Lentiviral-mediated gene correction of mucopolysaccharidosis type IIIA (Publicado el 16 de enero de 2007)


Lentiviral-mediated gene correction of mucopolysaccharidosis type IIIA

Resumen

Fondo

Mucopolisacaridosis tipo III (MPS III) es el más común de las mucopolisacaridosis. La enfermedad es causada por una deficiencia de la enzima lisosomal sulphamidase y los resultados en el almacenamiento del sulfato de glicosaminoglicanos (GAG), heparano. MPS IIIA se caracteriza por el almacenamiento extendido y la excreción urinaria de heparán sulfato, y un curso neurológico progresivo y profundo con el tiempo. La terapia génica es una de las pocas vías de tratamiento que mantienen la promesa de un tratamiento a largo plazo para este trastorno.

Métodos

El gen sulphamidase ADNc murino fue clonado en un vector lentiviral y el virus de alto título producido. Humanos MPS IIIA cultivos de fibroblastos fueron transducidas con el vector sulphamidase y analizados mediante técnicas moleculares, enzimáticos y metabólicos. De alto título de virus se inyecta por vía intravenosa en seis de 5 semanas de edad, los ratones MPS IIIA. Tres de estos ratones fueron pre-tratados con manitol hiperosmótico. El peso de los animales y se controló el contenido de GAG ​​en muestras de orina se analizó por electroforesis en gel de poliacrilamida.

Resultados

Transducción de cultivos de fibroblastos MPS IIIA con el gen corregido sulphamidase tanto los defectos enzimáticos y metabólicos. Sulphamidase secretada por las células corregidas gen-era capaz de cruzar correcta untransduced MPS IIIA células. GAG urinaria se encontró que se reduce en gran medida en muestras procedentes de los ratones que recibieron el vector en comparación con controles no tratados MPS IIIA. Además, el peso de los ratones tratados se hizo progresivamente normalizado sobre el 6 meses después del tratamiento.

Conclusión

Los vectores Lentivirales  parecen prometedores vehículos para el desarrollo de la terapia génica para MPS IIIA.

(…)

Discusión

La terapia génica de reemplazo para el MPS tiene varias ventajas potenciales sobre la terapia de reemplazo enzimático, el actual estándar de oro para el tratamiento donde se encuentra disponible. Estos incluyen una reducción en la frecuencia de tratamiento, una mejor eficacia y la posibilidad de ser capaz de tratar la enfermedad del SNC por la introducción de vectores de genes directamente en el SNC. Hasta hace poco, el desarrollo de la terapia génica para el MPS ha fracasado por la falta de adecuados vehículos de administración de genes. En general, los vectores integrativos parecería ser preferible para trastornos metabólicos tales como el MPS, puesto que dan estabilidad genética en el gen transducidas y por lo tanto el potencial de efectos a largo plazo. Debido a esto, los vectores retrovirales han sido durante mucho tiempo el vehículo de suministro de genes de elección. Sin embargo, los vectores derivados del oncogénicos vectores retrovirales son incapaces de transducir células no-ciclistas[ 13 ], lo que limitaba su utilidad. Por esta razón, y otros, han desarrollado vectores lentivirales[ 14 , 2225 ]. Estos tienen los atributos positivos generales de vectores retrovirales con la característica adicional de ser capaz de transducir células no-ciclistas, lo que significa que tienen una gran utilidad para in vivo la entrega de genes. Esto ha conducido a la utilización de vectores lentiviral en el desarrollo de la terapia génica para una variedad de trastornos, incluyendo el MPS[ 2629 ].

En este estudio hemos construido un vector lentiviral y demostró la prueba de los experimentos de principio in vitro . Las células humanas fueron utilizados para estos experimentos, simplemente por comodidad, sino que estaban disponibles de inmediato, mientras que los cultivos de control y fibroblastos MPS IIIA murino no lo eran. Lentiviral mediada por la entrega de genes de los fibroblastos humanos de piel MPS IIIA dio lugar a la corrección de los defectos metabólicos y enzimáticos exhibidos por estas células, incluso a la dosis más baja de virus utilizado. Además, la corrección completa del defecto metabólico en cultivos de células MPS IIIA con el menor número de copia del vector, y el hecho de que el medio secretada por las células gen corregido fue capaz de atravesar-corregir el defecto metabólico en células no transducidas, se muestra el potencial de la terapia génica a afectar a las células múltiples, además de los directamente transducidas por el vector. En el experimento transversal corrección no fue posible determinar si la absorción de la enzima fue a través de la manosa-6-fosfato (M6P) del receptor, como la corrección metabólica se observó cuando la enzima se añadió en la presencia o ausencia de M6P (datos no presentados). Además, la actividad sulphamidase era demasiado baja para ser detectada en todas las muestras del experimento corrección cruz. Esto, al menos en parte, refleja la sensibilidad relativamente baja del ensayo enzimático, y en parte los niveles relativamente bajos de actividad de la enzima en el medio acondicionado utilizado (hacia el menor nivel de actividad que puede ser fácilmente detectado).

En el in vitro estudio el promotor PGK parece ser relativamente débil, como el nivel de expresión obtenido con el vector no era mayor que la encontrada en las células normales, lo que sugiere que puede ser útil para evaluar el nivel de expresión de otros promotores. Sin embargo, el uso de promotores fuertes deben desarrollarse con precaución ya que aumentan el riesgo de mutagénesis de inserción a través de la activación oncogen[ 30 ].

El desarrollo de un ensayo de PCR en tiempo real para nuestro vector, y la línea de control de la célula que contiene una única copia de nuestro vector, serán útiles en estudios adicionales, por ejemplo determinación del número de vector de copia en los tejidos después in vivo de la administración. Mediante la selección cuidadosa de las secuencias del vector que la PCR en tiempo real detecta que hemos hecho este análisis genérico de manera que detecte todas las versiones de nuestro vector, cualquiera que sea la secuencia de transgen o promotor del vector lleva.

Vector se administró a ratones MPS IIIA ya sea con o en ausencia de un hiperosmótico manitol pre-tratamiento. En los estudios presentados en este documento estos dos conjuntos de los animales no podían distinguirse, por lo tanto, todos los animales fueron agrupados para su análisis. Administración del vector a MPS IIIA ratones dio lugar a la normalización parcial de GAG en orina como se evidencia por análisis PAGE gradiente, dando una primera indicación de la in vivo eficacia. El poder del sistema PAGE gradiente de[ 20 ] es que permite la evaluación específica de la pequeña a las moléculas de gran tamaño GAG libres (es decir, cuatro a treinta residuos sacáridos de longitud) típico de material de almacenamiento lisosomal, en lugar de GAG libre pequeño (di-a tetra-sacáridos) que puede ser analizados por espectrometría de masas, o el total (libre y conjugada) GAG medido por análisis del ácido urónico.

El peso de los animales tratados fue también progresivamente normalizado, lo que sugiere que el tratamiento es tener un efecto generalizado sobre la patología de la enfermedad a pesar de que la actividad enzimática no se pudo detectar en muestras de sangre de los ratones tratados (datos no presentados). Un análisis más detallado de estos animales está en curso y será publicado en otro lugar.

En conclusión, lentiviral vectores parecen ser prometedores reactivos para el desarrollo de una terapia eficaz para la MPS IIIA. El trabajo futuro se implican en vivo la entrega del vector a células somáticas y del SNC y el análisis detallado de la fenotipo de la enfermedad en los animales tratados.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el financiamiento de la Salud Nacional de Australia y el Consejo de Investigación Médica, el Consejo Nacional (EE.UU.) Sociedad de la MPS, y la Universidad de Adelaida. Nos gustaría dar las gracias a Kate Dowling, Biometrics SA, de la Universidad de Adelaida, en busca de ayuda con el análisis estadístico de los pesos corporales.

EL ARTICULO ES MUCHO MAS EXTENSO VEA EL ORIGINAL AQUI

http://www.gvt-journal.com/content/5/1/1

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Publicado por

mpspapas

Papa de dos nenas MPS

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