Ensayo sobre terapia genica en modelo perro de los sindromes Sanfilippo y Hurler


Original Article http://www.nature.com/mt/journal/v19/n2/full/mt2010265a.html

Molecular Therapy (2011)

Safe, Efficient, and Reproducible Gene Therapy of the Brain in the Dog Models of Sanfilippo and Hurler Syndromes

La terapia génica logra un importante avance contra la leucemia

Extracto del original…

(…) Presentamos aquí un estudio exhaustivo de 25 perros adultos que se sometieron a la terapia génica directa mediada por AAV en el cerebro y 13 perros control no tratados.

Este estudio amplía y confirma las conclusiones anteriores sobre la seguridad y eficacia de este tratamiento en modelos caninos de MPS.  Ofrecemos pruebas de la tolerancia y la mejora fenotípica en MPSIIIB, una enfermedad que representa un buen candidato para la evaluación clínica de la terapia génica.

Los resultados obtenidos en los dos modelos de perros investigados son plenamente compatibles. El elevado número de animales que fueron tratados de manera segura y con éxito hace hincapié en la reproducibilidad del procedimiento y su idoneidad para la aplicación humana.

Entrega de vectores de AAV al cerebro.
La eficiente difusión de partículas de vector en el cerebro es crucial para el tratamiento de enfermedades como las MPS en el que la patología está muy extendida en el sistema nervioso central.

Anteriormente puso de manifiesto en los ratones, 13 perros, 15 y monos 17 que los depósitos quirúrgicos de partículas vectores AAV5  garantiza un reparto eficiente en todo el cerebro. Estas observaciones se confirmaron completamente en el presente estudio realizado en un gran número de perros.

Los resultados mostraron que después de ocho depósitos de partículas de AAV5 en el cerebro a través de cuatro pistas de estereotaxia, la proporción media del cerebro perro en el cual se detectaron  estaba en el rango de 85%.

Ocho perros mostraron vg en todos los territorios investigados. Propagación similar fue observada cuando AAV2 y AAV5 genomas fueron empaquetados en partículas de AAV5.

Dos perros que recibieron una dosis cuatro veces mayor vector fueron positivos en todo el cerebro, pero sólo uno presentaron un mayor número de copias vg que el valor medio de los 23 animales tratados con la dosis regular de 5 × 1011 vg, lo que sugiere que la eficiencia de la prestación vector a los tejidos cerebrales no era estrictamente relacionada con la cantidad de partículas de vector depositados. Para el mismo lote de vectores, vg número de copias en los tejidos eran en realidad muy variable en función del animal y el territorio cerebro examinado.

El análisis de dos perros sanos, que recibieron el vector  fueron seguidos durante ~ 1 año, indicó que un gran número de copias del vector y de amplia distribución persistia en el cerebro a largo plazo.

La deposición de partículas del vector fue bien tolerada. El examen de los puntos de inyección en varios puntos de tiempo después de la deposición de vectores (de 3 semanas a 13,5 meses) no reveló, en presencia de inmunosupresión concurrente, ya sea inflamación local persistente, o secuela de la reacción inflamatoria, incluso en los animales que recibieron el vector más alto dosis (2 × 1011 vg en cada sitio de depósito).

Por lo tanto, un depósito de 2 × 1011 vg fue bien tolerado.

Este hallazgo es importante cuando se habla de la adecuada dosificación de vectores para el tratamiento de pacientes humanos. Tolerancia vectorial era igual de bueno y la difusión igualmente eficiente en los dos perros  MPSIIIB que recibieron partículas de vector producidas en células de insecto usando vectores de baculovirus, en comparación con los perros que recibieron vector AAV preparado por co-transfección de células 293 de riñón embrionario humanos humanos con ADN plásmido. El método de producción de vector de AAV basado en el uso de vectores de baculovirus para entregar los componentes de embalaje a las células Sf9 se adapta bien a los procesos de fabricación a gran escala requeridos para lotes clínicos preparation. Nuestros resultados indican que este método de producción se debe considerar para los ensayos en humanos.

Corrección de la enfermedad
Los modelos perros MPSI y  MPSIIIB no expresaban manifestaciones clínicas de la enfermedad del sistema nervioso central en los animales a la edad que fueron tratados y seguidos. Considerando que la ataxia se produce en la etapa avanzada de la enfermedad en los perros MPSIIIB, la edad del animal al inicio no es un marcador clínico fiable debido a grandes variaciones entre los animales afectados y de la ausencia de una descripción adecuada de la historia natural de la enfermedad canina.

La esperanza de vida, depende de la afección de los órganos periféricos en perros MPSI y de la decisión humana en el desarrollo de la ataxia en los modelos perro MPSIIIB ,ese  tampoco es un marcador clínico adecuado. Por lo tanto, confiamos en los marcadores bioquímicos (GAG y GM2/GM3 niveles) y los marcadores histológicos para evaluar la gravedad de la enfermedad en el cerebro del perro.

Ya que la patología asociada a MPSI y a MPSIIIB se extiende por todo el sistema nervioso central, estos marcadores fueron investigados en todo el cerebro usando metodologías adecuadas.
Los marcadores bioquímicos e histológicos se han mejorado constantemente en casi todo el cerebro en todos los perros tratados que recibieron inmunosupresor (16 perros).

Se observó mejoría de los marcadores bioquímicos con lesiones histológicas persistentes en algunos perros, que fueron examinados tempranamente después del tratamiento (0,7 meses), tres perros MPSI que fueron tratados después de la edad de 7,3 meses de edad , y dos perros MPSIIIB  que no recibieron inmunosupresor .

Estos resultados sugieren que el aclaramiento fue más rápido y más fácil de obtener para los productos almacenados que para las lesiones de almacenamiento. No sabemos cuál de estos marcadores es el más relevante para las manifestaciones clínicas en los niños. Con respecto al futuro, los ensayos terapéuticos, GAG y GM2/GM3 concentraciones de gangliósidos en el líquido cefalorraquídeo (LCR) representan posibles marcadores de la gravedad de la patología en el cerebro, y por lo tanto, los posibles puntos finales para la evaluación de la eficacia del tratamiento en ensayos humanos.

La observación de una posible disociación entre los marcadores bioquímicos e histológicos hace hincapié en la importancia de considerar los puntos finales clínicos en complemento a ensayos de biomarcadores en LCR para evaluar la eficacia del tratamiento en los niños.

Aunque los marcadores bioquímicos e histológicos  han mejorado constantemente en 16 perros tratados que recibieron inmunosupresor, el tratamiento no dio lugar a la resolución completa de la enfermedad asociada con el almacenamiento en el cerebro.

Considerando que los niveles de GAG ​​y GM2/GM3 gangliósidos estaban cerca de los valores normales, que se mantuvo elevado en relación con las de los perros normales, y lesiones histológicas residuales persistieron. No sabemos si esta enfermedad residual dará lugar a síntomas clínicos en niños tratados. La eficacia del tratamiento también fue limitado por la falta de mejora en el cerebelo, que era consistente con la ausencia casi total de VG en este tejido. Suponemos que será necesario tratar la enfermedad cerebelosa y signos asociados en los niños un depósito vector local adicional.

La edad de los perros MPSI en el momento del tratamiento afecta a la eficacia del mismo.  

Los cuatro perros MPSI tratados a partir de los 7,3 meses no mostraron ninguna mejora en los marcadores biológicos únicos , o en la mejora de los marcadores biológicos y si en  las lesiones histológicas cerca de los sitios de deposición de vectores pero no a sitios distantes . Estos resultados pueden representar un corolario edad en el modelo canino para jóvenes pacientes MPSI  gravemente afectados, donde se reconoce que el trasplante de células madre hematopoyéticas no es eficaz para los pacientes mayores de 24 meses.

En contraste, los perros MPSIIIB respondieron completamente al tratamiento cuando el tratamiento era iniciado a 9,2 ± 2,2 meses.

Este resultado sugiere diferente cinética de la progresión de la enfermedad se pueden aplicar a MPSI  y MPSIIIB canina.

La inmunosupresión
Un determinante importante de la seguridad y eficacia del tratamiento fue la inmunosupresión.

Confirmando nuestras observaciones anteriores en los perros que recibieron MPSI bajo régimen inmunosupresor, 15 nos muestran que la ausencia , o interrupción del inmunosupresor en perros MPSIIIB a resultado en número de copias bajo en vectoriales, ausencia de actividad NAGLU detectable en extractos de cerebro, casi sin cambios la gravedad de la patología y la reacción inflamatoria marcada.

Estos resultados indican inequívocamente que la inmunosupresión eficaz será obligatoria para la seguridad y eficacia del tratamiento en los niños.

La inmunización contra la enzima recombinante terapéutica es frecuente en niños que reciben la terapia de reemplazo de enzimas, incluyendo en pacientes con enzimática residual. Por lo tanto, la síntesis de una proteína mutante no induce necesariamente la tolerancia a la molécula de tipo salvaje. Anteriormente se puso de manifiesto que la respuesta inmune se dirige contra ambos los componentes del vector y enzima terapéutica en perros MPSI.

Por lo tanto, suponemos que una reacción similar se produjo contra NAGLU en los perros tratados con MPSIIIB.

Sin embargo, la presencia de anticuerpos anti-NAGLU en extractos de cerebro de perros tratados no podía ser documentado ya que los anticuerpos no están disponibles para este diseño de ensayos.

El bajo número de copias vg en los perros que no recibieron inmunosupresor es consistente con la eliminación inmune de las células transgénicas. Curiosamente, la mejora de los marcadores biológicos en B54 y B89 sugiere que la entrega transitoria de la enzima terapéutica que precede reacción inmune podría haber sido suficiente para eliminar productos de almacenamiento primario (GAGs), al menos parcialmente y de forma transitoria.

Este extenso estudio en perros proporciona la validación de un animal de gran tamaño para un tratamiento de las manifestaciones del sistema nervioso central de MPSI y MPSIIIB en los niños afectados utilizando la terapia génica mediada por AAV dirigida al cerebro.

Los pacientes con MPSIII representan el grupo de pacientes con MPS neuropáticos la necesidad más urgente de un tratamiento eficaz que sea dirigido  al cerebro.

En contraste con la MPSI, la MPSIII no parece ser mejorada por el trasplante de células madre hematopoyéticas y no está asociado con manifestaciones periféricas severas. El devastador curso natural de esta enfermedad puede mitigar la consideración de un enfoque valido para esta terapia, a pesar de los riesgos conocidos o potenciales e imprevisibles de la terapia génica, además de los riesgos bien documentados de inmunosupresión.

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Publicado por

mpspapas

Papa de dos nenas MPS

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